Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pitx3: sc-402995-ACT

PITX3 code le facteur de transcription à domaine homeobox de type paired Pitx3, un régulateur nucléaire qui contribue à spécifier l’identité des neurones dopaminergiques du mésencéphale et soutient la différenciation ainsi que le maintien neuronaux. Pitx3 agit au sein de réseaux transcriptionnels du développement qui s’articulent avec la signalisation Wnt/β-caténine, des programmes sensibles à l’acide rétinoïque et d’autres facteurs homeobox afin d’orienter les décisions de lignage et les états de maturation. Une régulation altérée de PITX3 a été associée à la vulnérabilité du système dopaminergique et est étudiée dans le cadre de la biologie des maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, notamment via des voies pertinentes pour la maladie de Parkinson. En tant que contrôleur transcriptionnel, Pitx3 est également utilisé pour explorer les circuits de régulation génique, les transitions d’état de la chromatine et la reprogrammation du destin cellulaire dans des modèles cellulaires humains.

Pitx3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PITX3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pitx3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PITX3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PITX3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pitx3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PITX3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pitx3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pitx3 dans les cellules tumorales présentant une expression de PITX3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.