Plásmido CRISPR de Activación (h) PFK-2/PFKFB2: sc-401358-ACT

PFKFB2 codifica la 6‑fosfofructo‑2‑quinasa/fructosa‑2,6‑bisfosfatasa 2 (PFK‑2/PFKFB2), una enzima bifuncional que controla los niveles celulares de fructosa‑2,6‑bisfosfato, un potente activador alostérico de PFK‑1 y del flujo glucolítico. Al ajustar el equilibrio entre la glucólisis y el potencial gluconeogénico, PFKFB2 conecta la disponibilidad de nutrientes con la producción de ATP, la homeostasis redox y el suministro de precursores biosintéticos. Su actividad se integra con la señalización de insulina/PI3K–AKT y con vías de quinasas sensibles al estrés que modulan la adaptación metabólica. La expresión desregulada de PFKFB2 o su regulación dependiente de la señalización se ha asociado con la reprogramación metabólica alterada observada en distintos modelos de enfermedades cardiometabólicas y proliferativas, lo que la convierte en un nodo útil para estudiar fenotipos centrados en la glucólisis.

PFK-2/PFKFB2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PFKFB2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PFK-2/PFKFB2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PFKFB2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PFKFB2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PFK-2/PFKFB2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PFKFB2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PFK-2/PFKFB2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PFK-2/PFKFB2 en células tumorales con expresión de PFKFB2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.