PEPCK-M/PCK2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400725-ACT

Il gene umano **PCK2** codifica l’isoforma mitocondriale della fosfoenolpiruvato carbossichinasi (PEPCK-M), un enzima chiave della gluconeogenesi che converte l’ossalacetato in fosfoenolpiruvato utilizzando GTP. Collegando l’anaplerosi/cataplerosi mitocondriale alla biosintesi citosolica di carboidrati e lipidi, PEPCK-M contribuisce a coordinare il flusso del ciclo TCA, l’equilibrio redox e la flessibilità metabolica dipendente dai nutrienti. L’attività di PCK2 è connessa al metabolismo centrale del carbonio e può influenzare vie quali la gluconeogenesi, la gliceroneogenesi e l’utilizzo del carbonio derivato dagli aminoacidi. Un’alterata espressione di PCK2 è stata associata alla riorganizzazione metabolica osservata nei disturbi dell’omeostasi del glucosio e nel metabolismo tumorale, rendendolo un nodo utile per studiare il controllo mitocondriale dei programmi biosintetici.

PEPCK-M/PCK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PEPCK-M/PCK2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PEPCK-M/PCK2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PEPCK-M/PCK2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PEPCK-M/PCK2 nelle cellule tumorali con espressione di PCK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.