Plásmido CRISPR de Activación (h) PCCA: sc-404791-ACT

PCCA codifica la subunidad alfa de la propionil‑CoA carboxilasa, una enzima mitocondrial dependiente de biotina que cataliza la conversión dependiente de ATP de propionil‑CoA a D‑metilmalonil‑CoA. Esta reacción es esencial para el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada, los ácidos grasos de cadena impar y las cadenas laterales del colesterol, conectando la utilización de aminoácidos y lípidos con la anaplerosis mitocondrial y el metabolismo energético. La función de PCCA se relaciona con el metabolismo de la biotina, la homeostasis de proteínas mitocondriales y las respuestas al estrés metabólico que influyen en el equilibrio redox y el manejo de ácidos orgánicos. La alteración patogénica de la actividad de PCCA se asocia con la acidemia propiónica, lo que la convierte en un objetivo útil para estudiar la disfunción metabólica, la señalización de estrés mitocondrial y las relaciones genotipo‑fenotipo en modelos celulares humanos.

PCCA El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PCCA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PCCA El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PCCA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PCCA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PCCA. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PCCA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PCCA en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PCCA en células tumorales con expresión de PCCA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.