Plásmido CRISPR de Activación (h) PAF-R: sc-402569-ACT

PTAFR codifica el receptor del factor activador de plaquetas (PAF-R), un GPCR de clase A que se une al factor activador de plaquetas y se acopla principalmente a la señalización de Gαq/11 y Gαi para regular la activación de la fosfolipasa C, el flujo intracelular de Ca²⁺ y los programas transcripcionales aguas abajo de MAPK y NF-κB. La actividad de PAF-R integra la detección de mediadores lipídicos inflamatorios con la quimiotaxis de leucocitos, la activación endotelial y la modulación de redes de citocinas y eicosanoides, influyendo en las respuestas inmunitarias innatas y en la permeabilidad vascular. La señalización desregulada de PTAFR/PAF-R se ha vinculado a procesos inflamatorios y alérgicos, a la activación inmunitaria asociada a infecciones y a la biología del microambiente tumoral, a través de efectos sobre el comportamiento de células mieloides y la función de barrera. Como receptor de membrana con señalización rápida inducida por ligando, constituye un nodo manejable para desentrañar la inflamación mediada por GPCR y la interrelación con la señalización lipídica.

PAF-R El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PTAFR sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PAF-R El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PTAFR en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PTAFR, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PAF-R. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PTAFR y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PAF-R en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PAF-R en células tumorales con expresión de PTAFR silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.