Plásmido CRISPR de Activación (h) p115: sc-403918-ACT

USO1 codifica el factor de anclaje de vesículas p115, una proteína conservada de tipo “coiled-coil” que coordina el transporte del retículo endoplásmico (RE) al Golgi y el transporte intra-Golgi al conectar las cubiertas vesiculares con componentes de la matriz del Golgi y con la maquinaria de SNARE. p115 contribuye al mantenimiento de la estructura del Golgi, al tráfico direccional de membranas y a la homeostasis de la vía secretora, influyendo así en el procesamiento de proteínas y su entrega a la superficie celular. La alteración del tráfico asociado a USO1 puede afectar la proteostasis, las respuestas al estrés y las salidas de señalización que dependen de una secreción regulada y del recambio de receptores de membrana. El transporte vesicular y la organización del Golgi desregulados se asocian con frecuencia a la transformación oncogénica y a fenotipos neurodegenerativos, lo que convierte a USO1 en un nodo útil para estudiar las consecuencias a nivel de vías de una disfunción secretora.

p115 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de USO1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

p115 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus USO1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional USO1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de p115. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo USO1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de p115 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía p115 en células tumorales con expresión de USO1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.