Plasmide CRISPR d'Activation (h) osteocalcin: sc-400299-ACT

BGLAP code l’ostéocalcine, une protéine de la matrice extracellulaire, dépendante de la vitamine K et γ-carboxylée, sécrétée par les ostéoblastes et incorporée à la matrice osseuse minéralisée. L’ostéocalcine participe à la formation et au remodelage osseux en influençant le dépôt d’hydroxyapatite, la maturation minérale et le couplage ostéoblaste–ostéoclaste, et elle est couramment utilisée comme marqueur de la différenciation ostéogénique. Son expression est régulée par des réseaux de signalisation ostéogéniques, notamment des programmes transcriptionnels pilotés par RUNX2 et des voies liées au métabolisme minéral. Une expression ou une maturation (processing) dérégulée de BGLAP/ostéocalcine est associée à des états de renouvellement osseux altérés et fournit un indicateur fonctionnel dans les études du développement du squelette et des mécanismes des maladies musculo-squelettiques.

osteocalcin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BGLAP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

osteocalcin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BGLAP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BGLAP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de osteocalcin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BGLAP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de osteocalcin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie osteocalcin dans les cellules tumorales présentant une expression de BGLAP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.