NSE1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402593-ACT

O NSMCE1 humano codifica a NSE1, um componente central do complexo SMC5/6 que protege a integridade do genoma durante a replicação e o reparo do DNA. A NSE1 possui atividade de ligase E3 de ubiquitina do tipo RING e coopera com outras subunidades do SMC5/6 para coordenar a estabilidade da forquilha de replicação, a recombinação homóloga e a resolução de intermediários de recombinação associados a danos no DNA. Por meio dessas vias, a NSE1 contribui para a segregação cromossômica e para a supressão de rearranjos genômicos deletérios sob estresse replicativo. A desregulação da função do complexo SMC5/6 está associada a fenótipos de instabilidade genômica relevantes para estudos de biologia do câncer, quebras cromossômicas e distúrbios de reparo do DNA.

NSE1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NSMCE1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NSE1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NSMCE1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NSMCE1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NSE1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NSMCE1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NSE1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NSE1 em células tumorais com expressão de NSMCE1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.