NPC1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403252-ACT

NPC1 (Morbus Niemann-Pick, Typ C1) kodiert ein Membranprotein der späten Endosomen/Lysosomen, das für den intrazellulären Transport von Cholesterin und Sphingolipiden erforderlich ist. Durch die Koordination des Lipidexports aus Lysosomen trägt NPC1 zur endolysosomalen Homöostase, zur Membranzusammensetzung und zu nachgeschalteten metabolischen Signalwegen bei, die mit Autophagie und lysosomaler Funktion verknüpft sind. Ein Verlust oder eine Beeinträchtigung von NPC1 stört die Cholesterinverarbeitung und die Organelldynamik, was zu einer lysosomalen Lipidakkumulation und breit angelegten zellulären Stressreaktionen führt. Eine Funktionsstörung von humanem NPC1 ist stark mit Morbus Niemann-Pick Typ C assoziiert und wird in Modellen der Neurodegeneration, der Lipidspeicherpathologie sowie von Wirt–Pathogen-Interaktionen, die vom endosomalen Transport abhängen, umfassend untersucht.

NPC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NPC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NPC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NPC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NPC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NPC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NPC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NPC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NPC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NPC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.