Plasmide CRISPR d'Activation (h) NHE-9: sc-410416-ACT

SLC9A9 code l’échangeur endosomal Na+/H+ NHE‑9, une protéine membranaire multipasse qui régule le pH luminal et l’homéostasie du sodium dans les endosomes de recyclage et de tri. En modulant l’acidification endosomale, NHE‑9 influence le trafic des récepteurs, la dissociation ligand–récepteur et l’équilibre entre recyclage et dégradation lysosomale, façonnant ainsi les sorties de signalisation et la composition des protéines membranaires. Cette fonction relie SLC9A9 aux réseaux de transport vésiculaire et aux processus dépendants du pH qui affectent l’activité synaptique, la régulation des transporteurs de nutriments et les réponses cellulaires au stress. Une expression altérée de SLC9A9 ou un contrôle perturbé du pH endosomal a été associé(e) à des phénotypes neurodéveloppementaux et à d’autres affections liées à un trafic et une signalisation dysfonctionnels.

NHE-9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC9A9 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NHE-9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC9A9 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC9A9, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NHE-9. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC9A9 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NHE-9 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NHE-9 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC9A9 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.