Plásmido CRISPR de Activación (h) NHE-1: sc-400748-ACT

SLC9A1 codifica el intercambiador humano Na+/H+ 1 (NHE-1), un antiportador de la membrana plasmática que expulsa H+ intracelular a cambio de Na+ extracelular para mantener el pH citosólico, regular el volumen celular y sostener la homeostasis iónica. La actividad de NHE-1 se conecta con la señalización por factores de crecimiento y con la remodelación del citoesqueleto para influir en la proliferación, la migración y la adaptación al estrés, y contribuye al control del metabolismo y de la actividad enzimática dependiente del pH. La disfunción de NHE-1 y la alteración de la homeostasis del pH se han relacionado con cambios en programas de supervivencia y motilidad celular en biología del cáncer, así como con mecanismos de lesión asociados a isquemia en investigación cardiovascular y neurológica. Debido a que NHE-1 acopla el transporte iónico con salidas de señalización, SLC9A1 se estudia con frecuencia en vías que involucran MAPK/ERK, las GTPasas Rho y las respuestas celulares a la hipoxia y al estrés oxidativo.

NHE-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC9A1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NHE-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC9A1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC9A1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NHE-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC9A1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NHE-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NHE-1 en células tumorales con expresión de SLC9A1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.