NDUFA6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405991-ACT

O NDUFA6 codifica uma pequena subunidade acessória do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial (NADH:ubiquinona oxidoredutase) que auxilia na montagem do complexo I e na transferência de elétrons durante a fosforilação oxidativa. Ao contribuir para a oxidação de NADH e para a manutenção do gradiente de prótons mitocondrial, o NDUFA6 influencia a produção de ATP, o equilíbrio redox e a sinalização metabólica a jusante. Alterações em componentes do complexo I podem promover disfunção mitocondrial, mudanças no manejo de espécies reativas de oxigênio e deslocamentos compensatórios no metabolismo central do carbono. Como fator do complexo I codificado no núcleo, o NDUFA6 é relevante para estudos de bioenergética mitocondrial e de mecanismos subjacentes a fenótipos de doenças mitocondriais associadas ao complexo I.

NDUFA6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NDUFA6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NDUFA6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NDUFA6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NDUFA6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NDUFA6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NDUFA6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NDUFA6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NDUFA6 em células tumorais com expressão de NDUFA6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.