Plásmido CRISPR de Activación (h) N-type Ca CP α1B: sc-402397-ACT

CACNA1B codifica la subunidad α1B formadora del poro de los canales de calcio tipo N dependientes de voltaje (CaV2.2), que median la entrada de Ca2+ inducida por despolarización en células excitables. La apertura del canal acopla la actividad de la membrana con la señalización intracelular de calcio, coordinando el acoplamiento de vesículas presinápticas y la liberación de neurotransmisores mediante vías dependientes de Ca2+ y quinasas posteriores. La actividad de CACNA1B determina la transmisión sináptica, la excitabilidad neuronal y la secreción neuroendocrina, y su variación funcional se ha asociado con alteraciones en el procesamiento del dolor y con fenotipos neuropsiquiátricos. Como componente central de las redes de señalización dependientes de calcio, CaV2.2 se estudia de forma rutinaria en modelos de fisiología sináptica y regulación de canales iónicos.

N-type Ca CP α1B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CACNA1B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

N-type Ca CP α1B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CACNA1B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CACNA1B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de N-type Ca CP α1B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CACNA1B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de N-type Ca CP α1B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía N-type Ca CP α1B en células tumorales con expresión de CACNA1B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.