Plasmide CRISPR d'Activation (h) MTMR5: sc-410999-ACT

SBF1 code MTMR5, une pseudophosphatase de la famille des myotubularines, catalytiquement inactive, qui sert d’échafaudage dans la signalisation des phosphoinositides et le trafic membranaire endosomal. MTMR5 interagit avec des myotubularines actives telles que MTMR2 pour réguler l’homéostasie du phosphatidylinositol-3-phosphate et du phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate, influençant la dynamique endosome–lysosome, le renouvellement des récepteurs et l’organisation du cytosquelette. Par ces mécanismes, SBF1 a été impliqué dans des voies contrôlant la myélinisation, le maintien axonal et les réponses au stress cellulaire. Des variations génétiques et une expression dérégulée de cet axe sont associées à des phénotypes de neuropathies héréditaires, ainsi qu’à des contextes plus larges de neurodéveloppement et de biologie tumorale, où la signalisation dépendante du trafic est altérée.

MTMR5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SBF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MTMR5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SBF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SBF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MTMR5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SBF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MTMR5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MTMR5 dans les cellules tumorales présentant une expression de SBF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.