MRP4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401912-ACT

O ABCC4 humano codifica a MRP4 (proteína 4 associada à resistência a múltiplos fármacos), um transportador da família ABC (ATP-binding cassette) que medeia o efluxo dependente de ATP de aniões orgânicos, incluindo nucleótidos cíclicos (cAMP/cGMP), prostaglandinas, leucotrienos, conjugados de ácidos biliares e diversos metabolitos xenobióticos. Ao regular segundos mensageiros intracelulares e mediadores lipídicos, a MRP4 influencia a sinalização por GPCR, vias de homeostase inflamatória e vascular e as respostas celulares ao stress. A atividade do ABCC4 também molda a farmacocinética e a exposição celular a análogos de nucleósidos e a outras pequenas moléculas através de uma depuração impulsionada pelo transporte. A expressão desregulada de ABCC4/MRP4 tem sido associada a alterações na sinalização inflamatória e a fenótipos de resposta a fármacos ligados a transportadores em múltiplos contextos de doença, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos da biologia de transportadores e do crosstalk de sinalização.

MRP4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ABCC4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MRP4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ABCC4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ABCC4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MRP4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ABCC4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MRP4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MRP4 em células tumorais com expressão de ABCC4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.