MKP-3 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400850-ACT

二重特異性ホスファターゼ6（DUSP6、別名MKP-3）は細胞質に局在するMAPキナーゼホスファターゼで、ERK1/2を選択的に脱リン酸化して不活性化し、RAS–RAF–MEK–ERKシグナル伝達カスケードに対する負のフィードバック制御を担います。ERKによって駆動される転写プログラムを抑制することで、MKP-3は増殖、分化、ならびにEGFRやFGFRなどの受容体型チロシンキナーゼ下流における刺激依存的なシグナル伝達動態に影響を与えます。DUSP6の発現量や活性の変化はMAPK経路の出力を再編し得ることが知られており、ERKシグナルが破綻している状況（複数のがん関連モデルや発生シグナルの研究など）で報告されています。経路のモジュレーターとして、DUSP6はMAPKのフィードバック制御やシグナル適応を解析するためにしばしば用いられます。

MKP-3 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性DUSP6の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

MKP-3 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における DUSP6 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はDUSP6転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性MKP-3の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のDUSP6遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるMKP-3依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびDUSP6発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるMKP-3経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。