Plasmide CRISPR d'Activation (h) Melan-A: sc-418014-ACT

MLANA code la protéine Melan-A, un antigène de différenciation des mélanocytes localisé dans les mélanosomes et impliqué dans la biogenèse des mélanosomes ainsi que dans l’organisation cellulaire liée aux pigments. Melan-A est étroitement associée aux programmes de lignée mélanocytaire gouvernés par des régulateurs transcriptionnels tels que MITF et participe à des voies qui soutiennent l’identité des mélanocytes, la présentation antigénique et la reconnaissance immunitaire. Son expression est couramment utilisée pour stratifier les cellules mélanocytaires et pour étudier les mécanismes qui contrôlent la pigmentation et la différenciation cellulaire. Une expression dérégulée de MLANA est fréquemment étudiée dans les néoplasies mélanocytaires et dans des contextes où les marqueurs de lignée mélanocytaire renseignent sur la biologie tumorale et les interactions avec le microenvironnement immunitaire.

Melan-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MLANA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Melan-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MLANA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MLANA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Melan-A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MLANA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Melan-A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Melan-A dans les cellules tumorales présentant une expression de MLANA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.