MBD2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401561-ACT

Humanes MBD2 (Methyl-CpG-bindendes Domänenprotein 2) ist ein „Reader“ der DNA-Methylierung, der an methylierte CpG-Dinukleotide bindet und dazu beiträgt, epigenetische Markierungen in transkriptionelle Effekte zu übersetzen. Über Interaktionen mit Komplexen des Chromatin-Remodelings und der Histondeacetylierung wie NuRD trägt MBD2 zur Genrepression, Chromatinverdichtung und zur Regulation linienspezifischer Programme bei. Es beeinflusst Prozesse wie Zelldifferenzierung, Immunsignalisierung und die Aufrechterhaltung der genomweiten epigenetischen Stabilität. Eine fehlregulierte MBD2-Aktivität und eine veränderte methylierungsabhängige Repression wurden mit aberranten transkriptionellen Netzwerken in Verbindung gebracht, wie sie bei Krebs und anderen Erkrankungen mit epigenetischem Ungleichgewicht beobachtet werden.

MBD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MBD2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MBD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MBD2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MBD2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MBD2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MBD2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MBD2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MBD2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MBD2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.