MATH-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404171-ACT

ATOH1 (noto anche come MATH-1) codifica un fattore di trascrizione basic helix–loop–helix che determina decisioni di destino cellulare durante lo sviluppo, con ruoli di rilievo nella neurogenesi e nella differenziazione delle linee sensoriali. Regolando programmi trascrizionali che controllano l’impegno dei progenitori, la differenziazione e la maturazione, ATOH1 si integra in reti di segnalazione dello sviluppo come l’inibizione laterale dipendente da Notch e, più in generale, nella restrizione del destino di linea guidata dalla cromatina. Un’espressione deregolata di ATOH1 è stata collegata ad alterazioni degli stati di differenziamento e a fenotipi proliferativi in molteplici contesti tissutali, rendendolo un nodo utile per lo studio del controllo trascrizionale delle vie di sviluppo. Nei modelli cellulari umani, la modulazione di ATOH1 supporta ricerche meccanicistiche sulle reti di regolazione genica dello sviluppo e su cambiamenti dell’identità cellulare rilevanti per la malattia.

MATH-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATOH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MATH-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATOH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATOH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MATH-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATOH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MATH-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MATH-1 nelle cellule tumorali con espressione di ATOH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.