MAD1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401885-ACT

O gene humano **MAD1L1** codifica a proteína *mitotic arrest deficient 1* (MAD1), um componente central do checkpoint de montagem do fuso, que protege a segregação cromossômica ao monitorar a ligação entre cinetócoro e microtúbulos. A MAD1 coopera com a MAD2 e outros fatores do checkpoint para promover a formação do complexo de checkpoint mitótico e inibir a atividade do APC/C-CDC20 até que a biorientação adequada seja alcançada, limitando assim a aneuploidia e a instabilidade cromossômica. Por seus papéis na temporização da mitose e na sinalização do checkpoint, o MAD1L1 é frequentemente estudado em vias que conectam a manutenção do genoma à progressão do ciclo celular. A desregulação do controle de checkpoint associado ao MAD1L1 tem sido implicada em fenótipos de instabilidade cromossômica observados em múltiplos contextos de câncer e em modelos de fidelidade mitótica comprometida.

MAD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MAD1L1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MAD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MAD1L1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MAD1L1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MAD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MAD1L1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MAD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MAD1 em células tumorais com expressão de MAD1L1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.