Plásmido CRISPR de Activación (h) Klotho: sc-400970-ACT

KL codifica Klotho, una proteína de membrana tipo I que actúa como correceptor obligatorio para la señalización endocrina de FGF, en particular FGF23, con el fin de regular la homeostasis del fosfato y de la vitamina D. El Klotho unido a membrana también modula múltiples nodos de señalización, incluidas las vías de insulina/IGF-1, Wnt/β-catenina y TGF-β, influyendo en las respuestas al estrés oxidativo, la senescencia celular y la remodelación de la matriz extracelular. Un ectodominio soluble de Klotho generado por “shedding” (escisión) puede actuar de manera paracrina/endocrina para afectar la actividad de canales iónicos y la señalización de factores de crecimiento en diversos tejidos. La desregulación de la expresión de KL se ha asociado con fenotipos relacionados con el envejecimiento y se ha estudiado en contextos como la enfermedad renal crónica, la remodelación cardiovascular, la disfunción metabólica y la neurodegeneración, como un vínculo mecanístico entre el metabolismo mineral y la homeostasis tisular.

Klotho El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KL sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Klotho El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KL en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KL, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Klotho. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KL y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Klotho en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Klotho en células tumorales con expresión de KL silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.