Plásmido CRISPR de Activación (h) KLK5: sc-404042-ACT

La peptidasa 5 relacionada con calicreína (KLK5) es una proteasa de serina secretada, de tipo tripsina, que participa en cascadas proteolíticas extracelulares que controlan la descamación epidérmica, la homeostasis de la barrera y la defensa innata. KLK5 regula el procesamiento de proteínas estructurales y activa otras calicreínas, contribuyendo a la remodelación de la matriz pericelular y a la señalización a través de receptores activados por proteasas (PAR). La actividad desregulada de KLK5 se ha relacionado con fenotipos cutáneos inflamatorios y con una diferenciación epitelial alterada, y la expresión de KLK5 se estudia con frecuencia como marcador del estado epitelial y de la remodelación del microambiente. En biología del cáncer y en investigación dermatológica, KLK5 se utiliza para estudiar cambios impulsados por proteasas en la invasión, la señalización de citocinas y las vías asociadas a la barrera.

KLK5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KLK5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

KLK5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KLK5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KLK5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de KLK5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KLK5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de KLK5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía KLK5 en células tumorales con expresión de KLK5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.