ITM1 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-405155-ACT-2

STT3A umano codifica la subunità catalitica del complesso oligosaccharyltransferasi (OST), che media la glicosilazione N-linked co-traduzionale dei polipeptidi nascenti nel reticolo endoplasmatico, contribuendo alla proteostasi, alla maturazione delle proteine di membrana e secrete e al controllo di qualità del RE. Attraverso il suo ruolo nella biogenesi delle glicoproteine, STT3A influenza vie quali la degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD), la risposta alle proteine non correttamente ripiegate (UPR) e il traffico di recettori e trasportatori che dipendono dalla corretta aggiunta degli N-glicani. La deregolazione della glicosilazione dipendente da STT3A è stata collegata a disturbi congeniti della glicosilazione e a fenotipi di adattamento allo stress osservati nelle malattie proliferative, in cui un’alterata elaborazione dei glicani può influenzare la segnalazione e le interazioni cellula–cellula. L’editing genetico o la perturbazione di STT3A in modelli cellulari umani è utile per analizzare la funzione del complesso OST, mappare i siti di glicosilazione e le dipendenze dei suoi client e interrogare come lo stress del RE e la maturazione delle glicoproteine incidano sulle reti di segnalazione cellulari.

ITM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STT3A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ITM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STT3A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STT3A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ITM1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STT3A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ITM1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ITM1 nelle cellule tumorali con espressione di STT3A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.