Plásmido CRISPR de Activación (h2) ITF: sc-416266-ACT-2

El TFF3 (factor trefoil 3) humano codifica el péptido secretado ITF, un factor trefoil asociado a mucinas que se expresa en niveles elevados en el intestino y en otros epitelios mucosos, donde contribuye a la integridad de la barrera al promover la restitución epitelial, la migración y las respuestas de reparación en zonas adyacentes a las heridas. TFF3/ITF interactúa con componentes del moco y modula señales vinculadas a la remodelación del citoesqueleto y a programas de supervivencia, incluidos procesos asociados a MAPK/ERK y PI3K/AKT, influyendo así en el mantenimiento de las uniones célula–célula y en la adaptación al estrés inflamatorio. Se ha descrito una expresión desregulada de TFF3 en contextos de lesión mucosa e inflamación crónica, y se estudia con frecuencia en trastornos gastrointestinales, así como en cánceres epiteliales, donde puede correlacionarse con fenotipos de diferenciación alterada, invasión y metástasis. La edición génica de TFF3 permite el análisis mecanístico de las vías de reparación mucosa, la comunicación epitelio–inmunitaria y la contribución de factores secretados en modelos de organoides, de barrera y del microambiente tumoral.

ITF El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TFF3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ITF El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TFF3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TFF3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ITF. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TFF3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ITF en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ITF en células tumorales con expresión de TFF3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.