IFT172 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404379-ACT

IFT172 codifica um componente do complexo B do transporte intraflagelar (IFT), essencial para o tráfego anterógrado nos cílios primários, sustentando a montagem do axonema, a manutenção ciliar e a transdução de sinais. Ao permitir o movimento de cargas no cílio, o IFT172 influencia vias de desenvolvimento e de homeostase dependentes de cílios, incluindo a sinalização Hedgehog e outros processos mediados por receptores que dependem de uma arquitetura ciliar íntegra. A ruptura ou desregulação de IFT172 está associada a fenótipos relacionados a ciliopatias, ligando o transporte ciliar alterado a defeitos no padrão tecidual, na função sensorial e no desenvolvimento de órgãos. Como fator de transporte ciliar, o IFT172 é amplamente utilizado para investigar mecanismos de ciliogênese, a dinâmica da sinalização mediada por cílios e relações genótipo–fenótipo em modelos celulares humanos.

IFT172 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de IFT172 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IFT172 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus IFT172 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição IFT172, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IFT172. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus IFT172 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IFT172 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IFT172 em células tumorais com expressão de IFT172 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.