HSPA2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400832-ACT

HSPA2 codifica un membro della famiglia HSP70 di chaperoni molecolari ATP-dipendenti che supporta la proteostasi promuovendo il ripiegamento dei polipeptidi nascenti, prevenendo l’aggregazione proteica e coordinando il rifoldaggio o la degradazione delle proteine danneggiate dallo stress. L’attività di HSPA2 si integra con la regolazione della risposta allo shock termico, con il controllo qualità delle proteine mediato da chaperoni e con l’adattamento cellulare allo stress proteotossico, influenzando processi quali la progressione del ciclo cellulare e la differenziazione. Nei tessuti umani, HSPA2 è particolarmente associata allo sviluppo delle cellule germinali e alla funzione spermatica, e un’espressione alterata è stata riportata in diversi contesti rilevanti per la patologia in cui risultano compromessi la proteostasi e la segnalazione dello stress, inclusi la biologia tumorale e la neurodegenerazione. Queste caratteristiche rendono HSPA2 un nodo utile per studiare programmi trascrizionali responsivi allo stress e la regolazione, dipendente da chaperoni, delle proteine “client”.

HSPA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSPA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSPA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSPA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSPA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSPA2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSPA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSPA2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSPA2 nelle cellule tumorali con espressione di HSPA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.