Plásmido CRISPR de Activación (h) HPRT: sc-417332-ACT

HPRT1 codifica la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT), una enzima clave en la vía de rescate de purinas que cataliza la conversión de hipoxantina y guanina en IMP y GMP utilizando PRPP. Al mantener la homeostasis del pool de nucleótidos, HPRT sustenta la síntesis de ADN/ARN e influye en las respuestas celulares al estrés metabólico y a la demanda de replicación. La actividad de HPRT1 es central en el metabolismo de las purinas, se intersecta con el flujo biosintético dependiente de PRPP y se utiliza ampliamente como locus marcador de selección en genética celular de mamíferos. Las variantes con pérdida de función en HPRT1 alteran el reciclaje de purinas y se asocian con errores innatos del metabolismo y fenotipos neuroconductuales, proporcionando un modelo manejable para estudiar la regulación metabólica y las relaciones genotipo–fenotipo.

HPRT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HPRT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HPRT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HPRT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HPRT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HPRT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HPRT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HPRT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HPRT en células tumorales con expresión de HPRT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.