Plasmide CRISPR d'Activation (h) HMGCL: sc-403841-ACT

HMGCL humain code la lyase 3‑hydroxyméthyl‑3‑méthylglutaryl‑CoA, une enzyme mitochondriale qui catalyse la dernière étape de la cétogenèse et contribue au catabolisme de la leucine en générant de l’acétoacétate et de l’acétyl‑CoA. Cette activité favorise l’adaptation cellulaire au jeûne et au stress métabolique en reliant le flux d’acétyl‑CoA issu des acides gras à la production de corps cétoniques et, en aval, au maintien de l’homéostasie énergétique. La fonction de HMGCL s’inscrit à l’interface du métabolisme carboné mitochondrial et de l’équilibre rédox, influençant la disponibilité de l’acétyl‑CoA pour des processus de biosynthèse et de signalisation. Une altération de l’activité de HMGCL est associée à des erreurs innées du métabolisme affectant la production de corps cétoniques et peut être étudiée dans des contextes où le remaniement du métabolisme mitochondrial et l’utilisation des nutriments influencent les phénotypes cellulaires.

HMGCL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HMGCL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HMGCL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HMGCL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HMGCL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HMGCL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HMGCL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HMGCL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HMGCL dans les cellules tumorales présentant une expression de HMGCL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.