HES1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420832-ACT

Hes1 nel topo codifica il repressore trascrizionale bHLH (basic helix–loop–helix) HES1, un effettore canonico a valle della segnalazione Notch che orienta le decisioni sul destino cellulare sopprimendo geni proneurali e associati alla differenziazione. HES1 partecipa a oscillazioni trascrizionali che regolano il mantenimento dei progenitori, la tempistica della differenziazione e il patterning tissutale nel sistema nervoso e in altri organi. Attraverso il crosstalk con vie di segnalazione quali Wnt/β-catenina, Shh e TGF-β, HES1 contribuisce a coordinare l’equilibrio tra proliferazione e differenziazione e la specificazione di linea. Un’attività deregolata di HES1 è spesso studiata in contesti di segnalazione aberrante della via Notch, inclusi disturbi dello sviluppo e programmi oncogenici, in cui stati dei progenitori alterati e blocchi della differenziazione contribuiscono ai fenotipi di malattia.

HES1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hes1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HES1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hes1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hes1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HES1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hes1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HES1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HES1 nelle cellule tumorali con espressione di Hes1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.