Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{β 1}: sc-401901-ACT

GNB1 code la sous-unité humaine Gβ1, un composant central des protéines G hétérotrimériques qui couple les RCPG activés à des effecteurs en aval. Par la formation des complexes Gβγ et Gα, Gβ1 contribue à réguler la signalisation des seconds messagers, notamment les voies cAMP/PKA et Ca²⁺/PKC dépendantes de PLCβ, modulant ainsi la désensibilisation des récepteurs, la régulation des canaux ioniques et l’activation des cascades MAPK. La signalisation dépendante de GNB1 influence de nombreux processus cellulaires, dont la neurotransmission, la migration cellulaire et le contrôle métabolique. Une activité altérée de GNB1 et un déséquilibre de la signalisation des protéines G ont été associés à des phénotypes neurologiques et à une dérégulation plus large des voies contrôlées par les RCPG, pertinente pour les études des mécanismes de maladie.

Gβ 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNB1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gβ 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNB1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNB1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gβ 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNB1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gβ 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gβ 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNB1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.