Plásmido CRISPR de Activación (m) GRP94: sc-423491-ACT

El gen Hsp90b1 de ratón codifica GRP94 (gp96), una chaperona de la familia HSP90 residente en el retículo endoplásmico que favorece el plegamiento de proteínas, el control de calidad y la homeostasis del RE. GRP94 es esencial para la maduración y el tráfico de determinadas proteínas secretoras y de membrana, incluidas las integrinas y los receptores tipo Toll, influyendo así en la adhesión celular, la señalización inmunitaria innata y las vías mediadas por receptores. Su actividad está estrechamente acoplada a la señalización por estrés del RE y a la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), lo que vincula la regulación de Hsp90b1 con la proteostasis, la inflamación y la adaptación celular al estrés. La función desregulada de GRP94 se ha asociado con fenotipos inmunitarios alterados, disrupciones en la biología de la vía secretora y respuestas al estrés relevantes para enfermedad en modelos de cáncer y disfunción metabólica.

GRP94 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Hsp90b1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GRP94 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Hsp90b1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Hsp90b1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GRP94. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Hsp90b1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GRP94 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GRP94 en células tumorales con expresión de Hsp90b1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.