Plasmide CRISPR d'Activation (h) GlyT2: sc-403077-ACT

Le gène humain SLC6A5 code le transporteur de la glycine 2 (GlyT2), un transporteur présynaptique dépendant de Na⁺/Cl⁻ qui assure la recapture de la glycine à haute affinité dans les neurones glycinergiques inhibiteurs. En maintenant l’approvisionnement vésiculaire en glycine et en modulant la disponibilité synaptique de la glycine, GlyT2 joue un rôle central dans le recyclage des neurotransmetteurs, les circuits inhibiteurs de la moelle épinière et du tronc cérébral, ainsi que dans la régulation globale du traitement moteur et sensoriel. La fonction de SLC6A5 s’inscrit à l’interface des voies de transport des solutés, du transport membranaire couplé aux ions et de la transmission synaptique, qui influencent l’excitabilité neuronale. Une activité ou une expression altérée de GlyT2 est associée à une neurotransmission inhibitrice dérégulée et est pertinente pour la recherche sur les phénotypes héréditaires de sursaut et d’autres troubles du contrôle moteur.

GlyT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC6A5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GlyT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC6A5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC6A5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GlyT2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC6A5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GlyT2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GlyT2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC6A5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.