GlyT2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403077-ACT

Das humane SLC6A5 kodiert den Glycintransporter 2 (GlyT2), einen präsynaptischen, Na⁺/Cl⁻-abhängigen Transporter, der die hochaffine Wiederaufnahme von Glycin in inhibitorische glycinergische Neuronen vermittelt. Indem GlyT2 die vesikuläre Glycinversorgung aufrechterhält und die Verfügbarkeit von synaptischem Glycin mitbestimmt, ist er zentral für das Neurotransmitter-Recycling, die inhibitorischen Schaltkreise im Rückenmark und Hirnstamm sowie die übergeordnete Regulation der motorischen und sensorischen Verarbeitung. Die Funktion von SLC6A5 ist in Prozesse des Solute-Carrier-Transports, des ionengekoppelten Membrantransports und der synaptischen Signalübertragung eingebunden, die die neuronale Erregbarkeit beeinflussen. Eine veränderte GlyT2-Aktivität oder -Expression geht mit einer dysregulierten inhibitorischen Neurotransmission einher und ist für die Forschung zu erblichen Schreckphänotypen und anderen Störungen der motorischen Kontrolle relevant.

GlyT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC6A5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GlyT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC6A5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC6A5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GlyT2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC6A5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GlyT2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GlyT2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC6A5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.