Glutathione Peroxidase 4/GPX4 Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h): sc-401558

Descripción general

El GPX4 humano codifica la glutatión peroxidasa 4, una selenoenzima que reduce hidroperóxidos de fosfolípidos e hidroperóxidos de colesterol dentro de las membranas celulares utilizando glutatión, preservando así la integridad de la membrana bajo estrés oxidativo. GPX4 es un regulador central del control de la peroxidación lipídica y de la sensibilidad a la ferroptosis, conectando la homeostasis redox con la función mitocondrial y la señalización inflamatoria. La alteración de la actividad de GPX4 se asocia con respuestas desreguladas al daño oxidativo y con una susceptibilidad modificada a la muerte celular por ferroptosis, procesos implicados en la neurodegeneración, la biología del cáncer y el estrés cardiometabólico. Estas propiedades hacen de GPX4 un nodo clave para estudiar la desintoxicación de ROS lipídicas, las redes antioxidantes y las decisiones de destino celular en vías de adaptación al estrés.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO Glutathione Peroxidase 4/GPX4 (h) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen GPX4 en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus GPX4, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR Glutathione Peroxidase 4/GPX4 (h) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido GPX4.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido Glutathione Peroxidase 4/GPX4 CRISPR/Cas9 KO (h):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto GPX4.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus GPX4 y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones GPX4 críticos para la función Glutathione Peroxidase 4/GPX4
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.