Plasmide CRISPR d'Activation (h) Gads: sc-402831-ACT

GRAP2 code pour la protéine adaptatrice Gads, un échafaudage de signalisation hématopoïétique qui relie LAT phosphorylée à SLP-76 afin d’assembler le signalosome du récepteur des lymphocytes T (TCR). Grâce à ses domaines SH2 et SH3, Gads coordonne le recrutement de complexes effecteurs favorisant l’activation de PLCγ1, les flux calciques, la signalisation MAPK et les programmes transcriptionnels en aval qui contrôlent l’activation, la différenciation et la production de cytokines des lymphocytes T. La fonction de GRAP2 est également pertinente pour la signalisation des récepteurs immunitaires dans d’autres lignées leucocytaires et influence le remodelage du cytosquelette ainsi que la formation de la synapse immunologique. Une signalisation GRAP2/Gads dérégulée a été associée à des réponses immunitaires altérées et est étudiée dans des contextes tels que l’immunodéficience, des mécanismes liés à l’auto-immunité et des réseaux de signalisation des hémopathies malignes.

Gads Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GRAP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gads Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GRAP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GRAP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gads. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GRAP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gads au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gads dans les cellules tumorales présentant une expression de GRAP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.