Plasmide CRISPR d'Activation (h) FACE-1: sc-403350-ACT

ZMPSTE24 humain code FACE-1, une métalloprotéase à zinc ancrée dans la membrane du réticulum endoplasmique, qui catalyse des étapes protéolytiques clés de la maturation de la prélamine A. En clivant l’extrémité C-terminale farnésylée de la prélamine A, FACE-1 favorise l’assemblage correct de la lamina nucléaire, la morphologie du noyau et l’organisation de la chromatine, reliant ainsi son activité à la stabilité du génome et à la régulation du cycle cellulaire. L’altération du traitement dépendant de ZMPSTE24 favorise l’accumulation d’intermédiaires toxiques de prélamine A et une mécanotransduction perturbée, associant cette voie à des phénotypes de vieillissement prématuré et à des états de stress cellulaire liés aux laminopathies. La fonction de FACE-1 est également pertinente pour la protéostasie plus large des membranes du RE et les réseaux de traitement des protéines modifiées par des lipides, qui influencent l’intégrité de l’enveloppe nucléaire.

FACE-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ZMPSTE24 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FACE-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ZMPSTE24 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ZMPSTE24, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FACE-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ZMPSTE24 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FACE-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FACE-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ZMPSTE24 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.