EWS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401036-ACT

EWSR1 codifica la proteina legante l’RNA EWS, un membro della famiglia FET che collega la regolazione della trascrizione alla maturazione dell’RNA. EWS partecipa allo splicing co-trascrizionale, al trasporto dell’mRNA e alla dinamica dei granuli di stress, e interagisce con programmi trascrizionali dipendenti dalla RNA polimerasi II per modulare l’espressione genica. Riarrangiamenti cromosomici che coinvolgono EWSR1 generano proteine di fusione oncogeniche che riorganizzano le reti trascrizionali e sono centrali nella biologia del sarcoma di Ewing e di tumori correlati dei tessuti molli. Un’alterata funzione di EWSR1 è inoltre associata a difetti più ampi nella stabilità del genoma e nel metabolismo dell’RNA, rilevanti per studi meccanicistici sulla trasformazione cellulare e la differenziazione.

EWS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EWSR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EWS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EWSR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EWSR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EWS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EWSR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EWS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EWS nelle cellule tumorali con espressione di EWSR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.