EPHX2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402095-ACT

EPHX2 codifica l’epossido idrolasi solubile (sEH), un enzima bifunzionale che converte epossidi di acidi grassi bioattivi, come gli acidi epossieicosatrienoici (EET), in dioli meno attivi, modulando il tono dei mediatori lipidici in contesti vascolari, renali e immunitari. Attraverso questo ruolo nel metabolismo dell’acido arachidonico e, più in generale, degli ossilipini, EPHX2 influenza reti di segnalazione legate alla risoluzione dell’infiammazione, alla funzione endoteliale, alle risposte allo stress ossidativo e alla regolazione della pressione arteriosa. Alterazioni dell’attività di sEH e dei pattern di espressione di EPHX2 sono state associate a tratti cardiometabolici, a vie correlate all’ipertensione e a meccanismi di malattie infiammatorie, stimolando studi meccanicistici sul turnover degli epossidi lipidici. Nei modelli cellulari, la modulazione di EPHX2 viene utilizzata per indagare il cross-talk tra segnalazione lipidica, programmi citochinici e risposte trascrizionali attivate dallo stress.

sEH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPHX2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

sEH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPHX2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPHX2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di sEH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPHX2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da sEH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via sEH nelle cellule tumorali con espressione di EPHX2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.