EphA4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400729-ACT

EPHA4 kodiert EphA4, eine Rezeptor-Tyrosinkinase aus der Eph/Ephrin-Familie, die kontaktabhängige Signalübertragung vermittelt und so Axonführung, Synapsenbildung und Zellmigration reguliert. Die Aktivierung von EphA4 schaltet Rho‑Familien‑GTPase-Signalwege, MAPK‑Kaskaden und Umbaumechanismen des Zytoskeletts ein, um während der Entwicklung und auch in adulten Geweben Adhäsion und Grenzbildung zu steuern. In der menschlichen Biologie wird eine veränderte EPHA4-Signalgebung mit neuroentwicklungsbedingten und neurodegenerativen Phänotypen in Verbindung gebracht, und eine Fehlregulation der Eph-Rezeptoraktivität wird häufig im Kontext von Tumorzellinvasion und angiogener Signalgebung untersucht. Diese Funktionen machen EPHA4 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zur neuronalen Konnektivität, zur Gewebemusterbildung und zu rezeptorgetriebenen Signalnetzwerken.

EphA4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EPHA4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EphA4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EPHA4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EPHA4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EphA4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EPHA4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EphA4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EphA4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EPHA4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.