Plásmido CRISPR de Activación (h) Epac: sc-401807-ACT

RAPGEF3 codifica Epac (proteína de intercambio activada directamente por AMPc), un factor de intercambio de nucleótidos de guanina que vincula la señalización por AMPc con la activación de las pequeñas GTPasas Rap1 y Rap2. Mediante el control dependiente de Rap de la afinidad de las integrinas, la estabilidad de las uniones célula–célula y la dinámica del citoesqueleto, Epac regula la adhesión, la migración, la función de barrera y el tráfico vesicular en múltiples tipos celulares. La señalización de Epac se interseca con vías de AMPc independientes de PKA y se integra con redes reguladoras de MAPK y PI3K para modular la proliferación y las respuestas al estrés. La actividad desregulada de RAPGEF3/Epac se ha implicado en procesos relevantes para la invasión de células cancerosas, fenotipos cardiovasculares e inflamatorios y el control metabólico, lo que la convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos de vías.

Epac El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RAPGEF3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Epac El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RAPGEF3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RAPGEF3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Epac. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RAPGEF3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Epac en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Epac en células tumorales con expresión de RAPGEF3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.