Plásmido CRISPR de Activación (h) Ep-CAM: sc-400220-ACT

EPCAM codifica la molécula de adhesión celular epitelial (Ep-CAM), una glucoproteína transmembrana que media la adhesión homofílica célula–célula y contribuye a organizar la integridad epitelial, la polaridad y la señalización asociada a las uniones. Más allá de la adhesión, Ep-CAM participa en la proteólisis intramembrana regulada y en programas transcripcionales posteriores que se entrecruzan con vías de proliferación y diferenciación, incluido el diálogo con redes asociadas a Wnt/β-catenina. La expresión o localización alteradas de EPCAM se estudian con frecuencia en la biología de tumores epiteliales, fenotipos asociados a metástasis y modelos de transición epitelio–mesénquima, y las variantes con pérdida de función de EPCAM se han vinculado a trastornos intestinales congénitos como la enteropatía en penacho (tufting enteropathy). Como antígeno de superficie y marcador de linaje, Ep-CAM también se utiliza ampliamente para definir subpoblaciones epiteliales e investigar transiciones de estado celular en sistemas relevantes para el desarrollo y la enfermedad.

Ep-CAM El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EPCAM sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Ep-CAM El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EPCAM en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EPCAM, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Ep-CAM. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EPCAM y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Ep-CAM en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Ep-CAM en células tumorales con expresión de EPCAM silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.