Plásmido CRISPR de Activación (h) eIF4AIII: sc-402660-ACT

EIF4A3 codifica eIF4AIII, una helicasa de ARN tipo DEAD-box que actúa como componente central del complejo de unión a exones (EJC) depositado sobre ARNm empalmados. eIF4AIII coordina la regulación génica posranscripcional al acoplar el empalme del pre-ARNm con la exportación, localización, control de la traducción y la degradación del ARNm mediada por codones de terminación prematuros (NMD), contribuyendo así a la fidelidad del transcriptoma y a la proteostasis. A través de sus funciones en la vigilancia del ARN y el control de calidad dependiente del empalme, EIF4A3 influye en vías relacionadas con la progresión del ciclo celular, el mantenimiento del genoma y las respuestas al estrés. La desregulación de la actividad del EJC y de la NMD se ha asociado con un uso aberrante de isoformas y con cambios en la expresión de redes génicas oncogénicas y del neurodesarrollo, lo que convierte a EIF4A3 en un nodo relevante para estudios mecanísticos de defectos en el procesamiento de ARN.

eIF4AIII El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EIF4A3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

eIF4AIII El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EIF4A3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EIF4A3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de eIF4AIII. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EIF4A3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de eIF4AIII en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía eIF4AIII en células tumorales con expresión de EIF4A3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.