eIF4AIII Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402660-ACT

EIF4A3 codifica a eIF4AIII, uma helicase de RNA do tipo DEAD-box que atua como componente central do complexo de junção de éxons (EJC) depositado em mRNAs após o splicing. A eIF4AIII coordena a regulação gênica pós-transcricional ao acoplar o splicing do pré-mRNA à exportação do mRNA, à sua localização, ao controle da tradução e à degradação de mRNA mediada por códons sem sentido (NMD), moldando assim a fidelidade do transcriptoma e a proteostase. Por meio de seus papéis na vigilância de RNA e no controle de qualidade dependente de splicing, o EIF4A3 influencia vias ligadas à progressão do ciclo celular, à manutenção do genoma e às respostas ao estresse. A desregulação da atividade do EJC e do NMD tem sido associada ao uso aberrante de isoformas e à alteração da expressão de redes gênicas oncogênicas e do neurodesenvolvimento, tornando o EIF4A3 um nó relevante para estudos mecanísticos de defeitos no processamento de RNA.

eIF4AIII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EIF4A3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

eIF4AIII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EIF4A3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EIF4A3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de eIF4AIII. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EIF4A3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de eIF4AIII no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via eIF4AIII em células tumorais com expressão de EIF4A3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.