eIF3γ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418339-ACT

EIF3H codifica a subunidade gama do fator eucariótico de iniciação da tradução 3 (eIF3γ), um componente central do complexo eIF3 que coordena o recrutamento da subunidade ribossomal 40S, o carregamento de mRNA e o reconhecimento do códon de iniciação durante a iniciação da tradução dependente de cap. Ao regular a síntese proteica global e seletiva por transcrito, a eIF3γ influencia o crescimento celular, as respostas ao estresse e a proteostase, interagindo com vias como a sinalização de mTOR e programas de resposta integrada ao estresse que ajustam a produção translacional. Alterações na função do complexo eIF3 têm sido associadas ao controle desregulado da tradução observado em estados celulares proliferativos e adaptativos ao estresse, sustentando a investigação de EIF3H em modelos relevantes para doenças nos quais a reprogramação translacional contribui para o fenótipo.

eIF3γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EIF3H sem alterar a sequência de ADN subjacente.

eIF3γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EIF3H em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EIF3H, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de eIF3γ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EIF3H nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de eIF3γ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via eIF3γ em células tumorais com expressão de EIF3H silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.