eIF2Bε Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403917-ACT

EIF2B5 codifica a subunidade ε do fator de iniciação eucariótico 2B (eIF2Bε), o fator catalítico de troca de nucleotídeos de guanina que regenera o eIF2–GTP ativo para sustentar a iniciação da tradução dependente de cap. O eIF2Bε é um nó central na resposta integrada ao estresse (ISR), conectando a fosforilação de eIF2α à repressão traducional global, ao mesmo tempo que permite a tradução seletiva de transcritos adaptativos ao estresse. Por meio dessa regulação da proteostase e da dinâmica dos grânulos de estresse, o EIF2B5 influencia a homeostase neuronal e glial, programas de mielinização e a resiliência celular ao estresse metabólico e oxidativo. A disrupção patogênica da função do complexo eIF2B está associada à leucodistrofia da substância branca evanescente e a distúrbios relacionados do espectro eIF2B, tornando o EIF2B5 um alvo-chave para estudos mecanísticos da tradução regulada por estresse.

eIF2Bε O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EIF2B5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

eIF2Bε O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EIF2B5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EIF2B5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de eIF2Bε. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EIF2B5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de eIF2Bε no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via eIF2Bε em células tumorais com expressão de EIF2B5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.