Eg5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402276-ACT

O Eg5 humano (KIF11) codifica uma proteína motora de microtúbulos da família cinesina-5 que promove a separação dos centrossomos e a montagem do fuso bipolar durante a mitose, garantindo a correta congressão e segregação dos cromossomos. A função de Eg5 é integrada à dinâmica dos microtúbulos e ao controle do checkpoint de montagem do fuso, acoplando a motilidade dependente de ATP ao progresso adequado pela transição G2/M. A atividade desregulada de Eg5 compromete a integridade do fuso e favorece instabilidade cromossômica e aneuploidia, processos frequentemente investigados na biologia de doenças proliferativas. Como regulador mitótico central, Eg5 é amplamente utilizado para estudar o controle do ciclo celular, a mecânica do fuso e vias de estabilidade genômica.

Eg5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Eg5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição , onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Eg5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Eg5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Eg5 em células tumorais com expressão de silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.