EF-Tu CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404257-ACT

TUFM kodiert den humanen mitochondrialen Elongationsfaktor Tu (EF‑Tu), eine zentrale Komponente der mitochondrialen Translationsmaschinerie, die Aminoacyl‑tRNAs GTP‑abhängig zum Mitoribosom liefert. Indem EF‑Tu die Synthese von durch mtDNA kodierten Untereinheiten der oxidativen Phosphorylierung unterstützt, verknüpft er die mitochondriale Proteinproduktion mit dem Aufbau der Atmungskette, dem bioenergetischen Stofffluss und Proteostase-Programmen wie der mitochondrialen Unfolded-Protein-Response. Eine Störung der TUFM‑Aktivität kann die Funktion der Elektronentransportkette beeinträchtigen, oxidativen Stress erhöhen und die Mitophagie‑Signalgebung verändern, wodurch die EF‑Tu‑Biologie mit Mechanismen in Verbindung steht, die für die Forschung zu neuromuskulären und neurodevelopmentalen Erkrankungen breit relevant sind. Daher wird TUFM häufig in Zusammenhängen untersucht, die mitochondriale Dysfunktion, metabolische Umprogrammierung und Stressanpassung betreffen.

EF-Tu Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TUFM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EF-Tu Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TUFM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TUFM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EF-Tu-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TUFM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EF-Tu-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EF-Tu-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TUFM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.