E6BP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409673-ACT

RCN2 codifica a proteína humana de ligação a E6 (E6BP), uma proteína residente do retículo endoplasmático e ligante de cálcio, implicada na homeostase da via secretória. A E6BP contribui para o dobramento de proteínas dependente de cálcio e para o controle de qualidade no lúmen do RE, conectando-a à sinalização de estresse do RE e a processos associados à proteostase. Por meio dessas funções, RCN2 é relevante para respostas celulares que modulam o tráfego, a secreção e programas transcricionais adaptativos ao estresse. Alterações na proteostase do RE e no manejo de cálcio são frequentemente associadas a fenótipos relevantes para doenças, tornando RCN2 um alvo útil para estudos mecanísticos de sinalização de estresse e biologia da secreção.

E6BP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RCN2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

E6BP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RCN2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RCN2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de E6BP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RCN2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de E6BP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via E6BP em células tumorais com expressão de RCN2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.