Plásmido CRISPR de Activación (h) E6BP: sc-409673-ACT

RCN2 codifica la proteína humana de unión a E6 (E6BP), una proteína residente del retículo endoplásmico con capacidad de unión al calcio, implicada en la homeostasis de la vía secretora. E6BP contribuye al plegamiento de proteínas dependiente de calcio y al control de calidad dentro del lumen del RE, lo que la vincula a la señalización de estrés del RE y a procesos asociados a la proteostasis. A través de estas funciones, RCN2 es relevante para respuestas celulares que modulan el tráfico intracelular, la secreción y programas transcripcionales adaptativos al estrés. Las alteraciones de la proteostasis del RE y del manejo del calcio se asocian con frecuencia a fenotipos relevantes para enfermedad, lo que convierte a RCN2 en una diana útil para estudios mecanísticos de señalización de estrés y biología secretora.

E6BP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RCN2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

E6BP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RCN2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RCN2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de E6BP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RCN2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de E6BP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía E6BP en células tumorales con expresión de RCN2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.