Plásmido CRISPR de Activación (h) Dyskerin: sc-401278-ACT

El DKC1 humano codifica la disquerina, una proteína nucleolar esencial que estabiliza el complejo RNP nucleolar pequeño H/ACA y cataliza la seudouridilación del rRNA y del snRNA, respaldando la biogénesis de ribosomas y la fidelidad del empalme del pre-ARNm. La disquerina también se asocia con la holoenzima telomerasa mediante la unión al componente de ARN de la telomerasa, contribuyendo al mantenimiento de los telómeros y a la estabilidad del genoma. A través de estas funciones, DKC1 integra el procesamiento de ARN con el control del ciclo celular, las respuestas al daño del ADN y la proteostasis bajo estrés proliferativo. La desregulación o mutación de DKC1 se vincula con trastornos de la biología de los telómeros y con una homeostasis hematopoyética y epitelial alterada, lo que lo convierte en un objetivo clave para estudios mecanísticos del ensamblaje de ribonucleoproteínas y de la función nucleolar.

Dyskerin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DKC1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Dyskerin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DKC1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DKC1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Dyskerin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DKC1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Dyskerin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Dyskerin en células tumorales con expresión de DKC1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.