desmoplakin I/II CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400818-ACT

DSP kodiert Desmoplakin I/II, einen zentralen zytolinker Bestandteil von Desmosomen, der Intermediärfilamente an die desmosomalen Plaques verankert und so die Integrität von Epithel- und Herzgewebe unter mechanischer Belastung aufrechterhält. Durch Interaktionen mit Desmogleinen, Desmocollinen, Plakoglobin und Plakophilinen unterstützt Desmoplakin die Zell‑Zell‑Adhäsion, die Organisation des Zytoskeletts sowie den Umbau von Zellkontakten während der Differenzierung und der wundassoziierten Re‑Epithelialisierung. Störungen der DSP-Expression oder der Desmosomenstabilität stehen mit einer beeinträchtigten Barrierefunktion und veränderter Mechanotransduktion in Zusammenhang, was für kardiomyopathische und Hautfragilitäts‑Phänotypen relevant ist. Diese Eigenschaften machen DSP zu einem geeigneten Ziel, um junctionales Signaling, die Dynamik von Intermediärfilamenten und stressresponsive Signalwege zu untersuchen, die Adhäsion mit der Gewebehomöostase koppeln.

desmoplakin I/II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DSP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

desmoplakin I/II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DSP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DSP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen desmoplakin I/II-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DSP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von desmoplakin I/II-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des desmoplakin I/II-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DSP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.