Plásmido CRISPR de Activación (h) DAD1: sc-404172-ACT

El DAD1 humano (defensor frente a la muerte apoptótica 1) codifica una subunidad esencial del complejo oligosacariltransferasa (OST) en el retículo endoplásmico, donde contribuye a la glicosilación N‑ligada y a la proteostasis durante la maduración cotraduccional de proteínas. Al mantener la homeostasis del RE, DAD1 influye en la señalización de la respuesta a proteínas mal plegadas y en la susceptibilidad a la apoptosis en condiciones de estrés celular. Se ha relacionado la alteración de la expresión o la función de DAD1 con una desregulación de los programas de supervivencia celular y de procesos dependientes de glucoproteínas relevantes para la transformación oncogénica y la degeneración tisular. Como componente central de la red de control de calidad proteica, DAD1 se estudia con frecuencia en vías que conectan el estrés del RE, la biogénesis de proteínas de membrana y las decisiones sobre el destino celular.

DAD1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DAD1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DAD1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DAD1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DAD1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DAD1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DAD1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DAD1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DAD1 en células tumorales con expresión de DAD1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.