Plásmido CRISPR de Activación (m) CYP7A1: sc-419932-ACT

El gen murino Cyp7a1 codifica la colesterol 7α-hidroxilasa (CYP7A1), una enzima del citocromo P450 enriquecida en el hígado que cataliza el paso limitante de la velocidad en la vía clásica de síntesis de ácidos biliares a partir del colesterol. Al controlar la conversión de colesterol en 7α-hidroxicolesterol, CYP7A1 determina el tamaño y la composición del pool de ácidos biliares, influyendo en la señalización enterohepática a través de FXR/FGF15 y en la regulación posterior del metabolismo de lípidos, glucosa y energía. La actividad de Cyp7a1 integra la homeostasis hepática del colesterol con programas transcripcionales dependientes de ácidos biliares, en interacción con el metabolismo de lipoproteínas y redes de procesamiento de xenobióticos. La expresión desregulada de CYP7A1 se estudia con frecuencia en el contexto de la hipercolesterolemia, fenotipos de hígado graso y modelos de inflamación metabólica en los que la señalización por ácidos biliares está alterada.

CYP7A1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Cyp7a1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CYP7A1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Cyp7a1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Cyp7a1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CYP7A1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Cyp7a1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CYP7A1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CYP7A1 en células tumorales con expresión de Cyp7a1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.